1. 范围

本方法规定了保健食品中总黄酮的分光光度测定方法。
本方法适用于以含黄酮类成分为主要原料的保健食品中总黄酮含量的测定。
 
第一法

2. 原理

试样中的总黄酮经乙醇提取、聚酰胺粉吸附、甲苯和甲醇洗脱净化后，以芦丁为对照样品，采用分光光度法在360nm波长下测定总黄酮的吸光度，标准曲线法进行定量。
 

3. 试剂和材料

注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水或三级水。
3.1 试剂
3.1.1乙醇（C₂H₅OH）。
3.1.2聚酰胺粉。
3.1.3甲苯（C₇H₈）。
3.1.4甲醇（CH₃OH）。
3.2 标准品
芦丁标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1，纯度≥90%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
表1 芦丁标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称	英文名称	CAS登录号	分子式	相对分子量
芦丁	Rutoside	153-18-4	C27H30O16	610.52

3.3 标准溶液配制
3.3.1芦丁标准储备液：称取在102℃烘箱中恒重后的芦丁标准样品（3.2）5.0mg（精确至0.01mg），加甲醇溶解，并转移至100mL容量瓶中定容至刻度，此溶液浓度为50μg/mL。
3.3.2芦丁标准系列工作液：精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的标准储备液（3.3.1），分别置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成芦丁浓度分别为0.0μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL的标准系列工作液。
 

4. 仪器和设备

4.1 紫外/可见分光光度计。
4.2 超声波清洗器。
4.3 层析柱。
4.4 分析天平：感量分别为0.01mg、0.0001g和0.001g。
 

5. 分析步骤

5.1 试样制备
称取一定量的试样，加乙醇（3.1.1）定容至25mL，摇匀，超声提取20min，放置，吸取上清液1.0mL，于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉（3.1.2）吸附，水浴挥去乙醇，然后转入层析柱（层析柱内径可根据每个产品具体情况确定）。先用20mL甲苯（3.1.3）洗脱，弃去甲苯液；然后用甲醇（3.1.4）洗脱，合并洗脱液并定容至25mL，即得。
5.2 标准曲线的制作
取标准系列工作液（3.3.2），于波长360nm测定吸光度，以芦丁标准工作液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
5.3 试样溶液的测定
取试样溶液（5.1），于波长360nm测定吸光度，根据标准曲线得到试样溶液中总黄酮的浓度，平行测定次数不少于两次。
 

6. 结果计算

试样中总黄酮含量按下式计算:

式中：
X—试样中总黄酮的含量，以芦丁（C₂₇H₃₀O₁₆）计， 单位为克每一百克或克每一百毫升（g/100g或g/100mL）；
C—试样溶液中总黄酮的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；
V₁—试样定容体积，单位为毫升（mL）；
V₂—吸取试样溶液体积，单位为毫升（mL）；
V₃—过柱后定容体积，单位为毫升（mL）；
M—试样取样量，单位为克或毫升（g或mL）。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。
 

7. 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
 

第二法

8. 原理

试样经预处理除杂后，以甲醇或60%乙醇溶液提取黄酮类成分。试样中的黄酮类成分可被亚硝酸钠还原，与硝酸铝生成络合物，在氢氧化钠溶液碱性条件下开环，生成2-羟基查尔酮而使溶液显特征的橙红色，采用分光光度法在510nm波长处测定吸光度，以芦丁为对照品，采用标准曲线法计算样品中总黄酮的含量。
 

9. 试剂和材料

注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水或三级水。
9.1 试剂
9.1.1 亚硝酸钠（NaNO₂）。
9.1.2 硝酸铝（Al(NO₃)₃·9H₂O）。
9.1.3 氢氧化钠（NaOH）。
9.1.4 石油醚（60～90℃)。
9.1.5 无水乙醇（CH₃CH₂OH）。
9.1.6 甲醇（CH₃OH）。
9.2 试剂配制
9.2.1 5%亚硝酸钠溶液：称取5.0g亚硝酸钠（9.1.1），加水溶解成100mL。
9.2.2 10%硝酸铝溶液：称取硝酸铝（9.1.2）17.6g，加水溶解成100mL。
9.2.3 氢氧化钠试液：称取氢氧化钠（9.1.3）4.3g，加水溶解成100mL。
9.2.4 60%乙醇：量取无水乙醇（9.1.5）60mL，加水至100mL。
9.3 标准品
芦丁标准样品：同3.2。
9.4 标准溶液配制
9.4.1 芦丁标准储备液：准确称取在102℃烘箱中恒重后的芦丁标准样品（9.3）20mg（精确至0.01 mg），加甲醇溶解，并转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度为0.2mg/mL。
 

10. 仪器和设备

10.1 紫外/可见分光光度计。
10.2 超声波清洗器。
10.3 离心机。

1. 索氏提取器。

10.5分析天平：感量分别为0.01mg、0.0001g和0.001g。
 

11. 分析步骤

11.1 试样制备
注：试样取样量、供试液取样体积可根据试样中总黄酮的含量适当调整，以保证测定的吸光度值在0.3～0.7范围内。
11.1.1 含油脂类固体样品与软胶囊：精密称取含油脂类固体样品或软胶囊内容物0.4g，置索氏提取器中，加石油醚（9.1.4）加热回流提取至提取液无色，弃去石油醚液，样渣挥去石油醚，转移至具塞锥形瓶中，精密加甲醇（9.1.6）25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液。
11.1.2 不含油脂类固体样品：精密称取适量，置于具塞锥形瓶中，精密加甲醇（9.1.6）25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液。
11.1.3 液体试样：精密吸取供试品2mL，置于25mL容量瓶中，加60%乙醇（9.2.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
11.2 标准曲线的制作
精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL的芦丁标准储备液（9.4.1），分别置于25mL容量瓶中，加水至6mL，加入5%亚硝酸钠溶液（9.2.1）1mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液（9.2.2）1mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液（9.2.3）10mL，摇匀，再加水至刻度，摇匀，放置15min，制成芦丁浓度分别为0.0μg/mL、 8.0μg/mL、16μg/mL、24μg/mL、32μg/mL、40μg/mL、48μg/mL的标准系列工作液。以0.0mL标准储备液制得的溶剂为空白，在波长510nm处分别测定吸光度值。以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。
11.3 试样溶液的测定
精密吸取供试品溶液（11.1）2mL，至25mL容量瓶中；照11.2，自加水至6mL起，……，至在510nm波长处测定吸光度，同法操作。从标准曲线上读出供试品溶液中含总黄酮的浓度，计算样品中总黄酮的含量。
 

12. 结果计算

试样中总黄酮含量按下式计算:
 
式中：
X—试样中总黄酮的含量，以芦丁（C₂₇H₃₀O₁₆）计， 单位为克每一百克或克每一百毫升（g/100g或g/100mL）；
C—标准曲线上读出供试品溶液中总黄酮的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；
V₁—试样定容体积，单位为毫升（mL）；
V₂—吸取试样溶液体积，单位为毫升（mL）；
V₃—显色定容体积，单位为毫升（mL）；
M—试样取样量，单位为克或毫升（g或mL）。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
 

13. 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的：15%（固体样品）、10%（液体样品）。
注：样品有颜色时，可采用样品标准添加法，以0号管调零，绘制标准曲线，以消除样品颜色干扰。