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保健食品中总皂苷的测定（2020年版）
2022-03-31 11:45:43
1 范围
本方法规定了保健食品中总皂苷的分光光度测定方法。
本方法适用于含五加科原料保健食品中总皂苷含量的测定。
第一法
2 原理
试样用水提取总皂苷类成分，过大孔树脂柱除杂后，试样中的皂苷类成分在高氯酸的作用下与香草醛反应，产生特征的紫红色，采用分光光度法测定560nm波长处的吸光度，进行定量。
3 试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 Amberlite-XAD-2 大孔树脂（或D-101大孔树脂）：20～60目，使用前应按照使用说明书进行活化处理。
3.1.2 中性氧化铝：层析用（100-200目）。
3.1.3 无水乙醇（CH3CH2OH）。
3.1.4 甲醇（CH3OH）。
3.1.5 高氯酸（HClO4）。
3.1.6 冰乙酸（CH3COOH）。
3.1.7 香草醛（C8H8O3）。
3.2 标准品
人参皂苷Re标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
表1 人参皂苷Re标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
3.3 标准溶液配制
人参皂苷Re标准储备液（0.2mg/mL）：准确称取人参皂苷Re标准样品（3.2）10mg（精确至0.01mg）于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。
3.4 试剂配制
3.4.1 70%乙醇：取无水乙醇70mL，加水使成100mL，混匀。
3.4.2 香草醛溶液：称取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100mL，混匀。
4 仪器和设备
4.1 紫外/可见分光光度计。
4.2 天平：感量分别为0.01mg和0.001g。
4.3 超声波清洗器。
4.4 恒温水浴锅。
5 分析步骤
5.1 试样制备
5.1.1 试样处理
5.1.1.1 固体试样
称取已粉碎混合均匀的待测试样1g（精确至0.001g）（或根据试样含总皂苷量而定），置于具塞锥形瓶中，加入水100.0mL，称重，超声30min，放冷，再用水补足减失重量，摇匀，放置，滤过，续滤液备用。
5.1.1.2 液体试样
含乙醇的液体试样，吸取混合均匀的待测试样10.0mL（或根据试样含总皂苷量而定）置水浴上挥尽乙醇后，用水转移至10mL容量瓶中，并用水稀释至刻度，备用；非乙醇类的液体试样，直接取样。
5.1.2 柱层析法
在内径为1.5cm的玻璃层析柱内装3cm已活化的大孔树脂（3.1.1），上加1cm中性氧化铝（3.1.2）。先用25mL70%乙醇（3.4.1）洗柱，弃去洗脱液，再用约25mL水洗脱至无醇味，弃去洗脱液，加入1.0mL已处理好的试样溶液（5.1.1），用25mL水洗脱，弃去洗脱液，再用25mL 70%乙醇（3.4.1）以不超过3mL/min的速度洗脱人参皂苷至洗脱液无色，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干，残渣用少量甲醇（3.1.4）溶解并转移至10mL具塞比色管中，备用。
5.2 标准曲线的制作
吸取人参皂苷Re标准溶液（3.3）0.0mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL于10mL具塞比色管中，置水浴中挥干溶剂，加入0.2mL香草醛溶液（3.4.2），再加入0.8mL高氯酸（3.1.5），混匀，使残渣全部溶解，置60℃水浴中加热10min，取出，冰浴冷却后，加入5.0mL冰乙酸（3.1.6），摇匀后，以相应试剂为空白，立即于560nm波长处测定吸光度。
5.3 试样溶液的测定
取5.1.2项下备用溶液 ，从5.2置水浴中挥干溶剂……”起，与标准溶液同法测定吸光度。
6 结果计算
试样中总皂苷含量（以人参皂苷Re计）按下式计算:
式中:
Xi—试样中总皂苷的含量（以人参皂苷Re计），单位为毫克每百克（mg/100g）或毫克每百毫升（mg/100mL）；
Ci—由标准曲线算得被测液中人参皂苷Re质量，单位为毫克（mg） ；
V—被测样品的稀释体积，单位为毫升（mL）；
V0—用于柱层析的样液体积，单位为毫升（mL）；
m—试样取样量，单位为克（g）或毫升（mL）；
100—单位转换。
计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。
7 精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 。
第二法
8 原理
试样用水提取总皂苷类成分，经水饱和正丁醇萃取除杂后，试样中的皂苷类成分在高氯酸的作用下与香草醛反应，产生特征的紫红色，采用分光光度法测定560nm波长处的吸光度，进行定量。
9 试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。
9.1 试剂
9.1.1 甲醇（CH3OH）。
9.1.2 石油醚：沸程（60～90℃）。
9.1.3 正丁醇（CH3(CH2)2CH2OH）。
9.1.4 无水乙醇（CH3CH2OH）。
9.1.5 氨水（NH3.H2O）。
9.1.6 高氯酸（HClO4）。
9.1.7 冰乙酸 （CH3COOH）。
9.1.8 香草醛（C8H8O3）。
9.2 标准品
人参皂苷Re标准样品：同3.2。
9.3 标准溶液配制
人参皂苷Re标准储备液（0.2 mg/mL）：同3.3。
9.4 试剂配制
9.4.1 香草醛溶液：同3.4.2。
9.4.2 水饱和正丁醇溶液：取正丁醇适量，加入适量水，充分振摇，静置使分层，上层液体即为水饱和正丁醇。
9.4.3 氨试液：取氨水40mL，加水使成100mL，混匀。
10 仪器和设备
10.1 紫外/可见分光光度计。
10.2 天平：感量为0.01mg和0.001g。
10.3 超声波清洗器。
10.4 离心机：转速 ≥4000r/min。
10.5 恒温水浴锅。
11 分析步骤
11.1 试样制备
11.1.1 试样处理
11.1.1.1 固体试样
称取已粉碎混合均匀的待测试样1g（精确至0.001g）（或根据试样含总皂苷量定），置于具塞锥形瓶中，加入水100.0mL，称重，超声30min，放冷，再用水补足减失重量，摇匀，放置，滤过，续滤液备用。
11.1.1.2 液体试样
含乙醇的液体试样，吸取混合均匀的待测试样10.0mL（或根据试样含总皂苷量而定）置水浴上挥尽乙醇后，用水转移至10mL容量瓶中，并用水稀释至刻度，备用；非乙醇类的液体试样，直接取样。
11.1.1.3 含油基质试样
称取已混合均匀的待测试样0.5g（或根据试样含总皂苷量而定）置于100mL离心管中，加入20mL石油醚（9.1.2），涡旋混合1min，4000r/min离心5min，弃去上清液，残渣挥干石油醚后，加入水50.0mL，称重，超声30min，放冷，再用水补足减失重量，摇匀，放置，滤过，续滤液备用。
11.1.2 萃取除杂
取11.1.1.1、11.1.1.3项下备用溶液25.0mL置分液漏斗中；或将11.1.1.2项下备用溶液用水全部转移至分液漏斗中（非乙醇类液体试样直接取10.0mL）并加水至约25mL。加入20mL水饱和正丁醇（9.4.2）振摇萃取，分取正丁醇液（必要时可离心），重复操作3次，合并正丁醇液用20mL氨试液（9.4.3）洗涤，重复操作2次，弃去氨试液，以适宜方式（水浴、减压或氮吹）除去正丁醇液后，残渣用甲醇（9.1.1）溶解并转移至25mL量瓶中（液体样品则转移至10mL量瓶中），加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，备用。
11.2 标准曲线的制作
吸取人参皂苷Re标准溶液（9.3）0.0mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL于10mL具塞比色管中，置水浴中挥干溶剂，加入0.2mL香草醛溶液（9.4.1），再加入0.8mL高氯酸（9.1.6），混匀，使残渣全部溶解，置60℃水浴中加热10min，取出，冰浴冷却后，加入5.0mL冰乙酸（9.1.7），摇匀后，以相应试剂为空白，立即于560nm波长处测定吸光度。
11.3 试样溶液的测定
取11.1.2项下备用溶液1.0mL于10mL具塞比色管中，从11.2 “置水浴中挥干溶剂……”起，与标准溶液同法测定吸光度。
11.4 背景校正（如样品不存在背景干扰，无需校正）
吸取11.1.2项下备用溶液1.0mL于10mL具塞比色管中，置水浴中挥干溶剂，加入0.2mL冰乙酸（9.1.7），从11.2 “再精密加入0.8 mL高氯酸（9.1.6）……”起，与试样同法测定吸光度，做试样背景校正。
12 结果计算
试样中总皂苷含量（以人参皂苷Re计）按下式计算:
式中:
Xi—试样中总皂苷的含量（以人参皂苷Re计），单位为毫克每百克（mg/100g）或毫克每百毫升（mg/100mL）；
Ci—经试样背景校正后，由标准曲线算得被测液中人参皂苷Re质量，单位为毫克（mg） ；
V—被测样品的稀释体积，单位为毫升（mL）；
V0—用于显色的样液体积，单位为毫升（mL）；
m—试样取样量，单位为克（g）或毫升（mL）；
100—单位转换。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。
13 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 。
本方法规定了保健食品中总皂苷的分光光度测定方法。
本方法适用于含五加科原料保健食品中总皂苷含量的测定。
第一法
2 原理
试样用水提取总皂苷类成分，过大孔树脂柱除杂后，试样中的皂苷类成分在高氯酸的作用下与香草醛反应，产生特征的紫红色，采用分光光度法测定560nm波长处的吸光度，进行定量。
3 试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 Amberlite-XAD-2 大孔树脂（或D-101大孔树脂）：20～60目，使用前应按照使用说明书进行活化处理。
3.1.2 中性氧化铝：层析用（100-200目）。
3.1.3 无水乙醇（CH3CH2OH）。
3.1.4 甲醇（CH3OH）。
3.1.5 高氯酸（HClO4）。
3.1.6 冰乙酸（CH3COOH）。
3.1.7 香草醛（C8H8O3）。
3.2 标准品
人参皂苷Re标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
表1 人参皂苷Re标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
| 中文名称 | 英文名称 | CAS登录号 | 分子式 | 相对分子量 |
| 人参皂苷Re | Ginsenoside Re | 52286-59-6 | C48H82O18 | 947.15 |
人参皂苷Re标准储备液（0.2mg/mL）：准确称取人参皂苷Re标准样品（3.2）10mg（精确至0.01mg）于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。
3.4 试剂配制
3.4.1 70%乙醇：取无水乙醇70mL，加水使成100mL，混匀。
3.4.2 香草醛溶液：称取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100mL，混匀。
4 仪器和设备
4.1 紫外/可见分光光度计。
4.2 天平：感量分别为0.01mg和0.001g。
4.3 超声波清洗器。
4.4 恒温水浴锅。
5 分析步骤
5.1 试样制备
5.1.1 试样处理
5.1.1.1 固体试样
称取已粉碎混合均匀的待测试样1g（精确至0.001g）（或根据试样含总皂苷量而定），置于具塞锥形瓶中，加入水100.0mL，称重，超声30min，放冷，再用水补足减失重量，摇匀，放置，滤过，续滤液备用。
5.1.1.2 液体试样
含乙醇的液体试样，吸取混合均匀的待测试样10.0mL（或根据试样含总皂苷量而定）置水浴上挥尽乙醇后，用水转移至10mL容量瓶中，并用水稀释至刻度，备用；非乙醇类的液体试样，直接取样。
5.1.2 柱层析法
在内径为1.5cm的玻璃层析柱内装3cm已活化的大孔树脂（3.1.1），上加1cm中性氧化铝（3.1.2）。先用25mL70%乙醇（3.4.1）洗柱，弃去洗脱液，再用约25mL水洗脱至无醇味，弃去洗脱液，加入1.0mL已处理好的试样溶液（5.1.1），用25mL水洗脱，弃去洗脱液，再用25mL 70%乙醇（3.4.1）以不超过3mL/min的速度洗脱人参皂苷至洗脱液无色，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干，残渣用少量甲醇（3.1.4）溶解并转移至10mL具塞比色管中，备用。
5.2 标准曲线的制作
吸取人参皂苷Re标准溶液（3.3）0.0mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL于10mL具塞比色管中，置水浴中挥干溶剂，加入0.2mL香草醛溶液（3.4.2），再加入0.8mL高氯酸（3.1.5），混匀，使残渣全部溶解，置60℃水浴中加热10min，取出，冰浴冷却后，加入5.0mL冰乙酸（3.1.6），摇匀后，以相应试剂为空白，立即于560nm波长处测定吸光度。
5.3 试样溶液的测定
取5.1.2项下备用溶液 ，从5.2置水浴中挥干溶剂……”起，与标准溶液同法测定吸光度。
6 结果计算
试样中总皂苷含量（以人参皂苷Re计）按下式计算:
式中:
Xi—试样中总皂苷的含量（以人参皂苷Re计），单位为毫克每百克（mg/100g）或毫克每百毫升（mg/100mL）；
Ci—由标准曲线算得被测液中人参皂苷Re质量，单位为毫克（mg） ；
V—被测样品的稀释体积，单位为毫升（mL）；
V0—用于柱层析的样液体积，单位为毫升（mL）；
m—试样取样量，单位为克（g）或毫升（mL）；
100—单位转换。
计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。
7 精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 。
第二法
8 原理
试样用水提取总皂苷类成分，经水饱和正丁醇萃取除杂后，试样中的皂苷类成分在高氯酸的作用下与香草醛反应，产生特征的紫红色，采用分光光度法测定560nm波长处的吸光度，进行定量。
9 试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。
9.1 试剂
9.1.1 甲醇（CH3OH）。
9.1.2 石油醚：沸程（60～90℃）。
9.1.3 正丁醇（CH3(CH2)2CH2OH）。
9.1.4 无水乙醇（CH3CH2OH）。
9.1.5 氨水（NH3.H2O）。
9.1.6 高氯酸（HClO4）。
9.1.7 冰乙酸 （CH3COOH）。
9.1.8 香草醛（C8H8O3）。
9.2 标准品
人参皂苷Re标准样品：同3.2。
9.3 标准溶液配制
人参皂苷Re标准储备液（0.2 mg/mL）：同3.3。
9.4 试剂配制
9.4.1 香草醛溶液：同3.4.2。
9.4.2 水饱和正丁醇溶液：取正丁醇适量，加入适量水，充分振摇，静置使分层，上层液体即为水饱和正丁醇。
9.4.3 氨试液：取氨水40mL，加水使成100mL，混匀。
10 仪器和设备
10.1 紫外/可见分光光度计。
10.2 天平：感量为0.01mg和0.001g。
10.3 超声波清洗器。
10.4 离心机：转速 ≥4000r/min。
10.5 恒温水浴锅。
11 分析步骤
11.1 试样制备
11.1.1 试样处理
11.1.1.1 固体试样
称取已粉碎混合均匀的待测试样1g（精确至0.001g）（或根据试样含总皂苷量定），置于具塞锥形瓶中，加入水100.0mL，称重，超声30min，放冷，再用水补足减失重量，摇匀，放置，滤过，续滤液备用。
11.1.1.2 液体试样
含乙醇的液体试样，吸取混合均匀的待测试样10.0mL（或根据试样含总皂苷量而定）置水浴上挥尽乙醇后，用水转移至10mL容量瓶中，并用水稀释至刻度，备用；非乙醇类的液体试样，直接取样。
11.1.1.3 含油基质试样
称取已混合均匀的待测试样0.5g（或根据试样含总皂苷量而定）置于100mL离心管中，加入20mL石油醚（9.1.2），涡旋混合1min，4000r/min离心5min，弃去上清液，残渣挥干石油醚后，加入水50.0mL，称重，超声30min，放冷，再用水补足减失重量，摇匀，放置，滤过，续滤液备用。
11.1.2 萃取除杂
取11.1.1.1、11.1.1.3项下备用溶液25.0mL置分液漏斗中；或将11.1.1.2项下备用溶液用水全部转移至分液漏斗中（非乙醇类液体试样直接取10.0mL）并加水至约25mL。加入20mL水饱和正丁醇（9.4.2）振摇萃取，分取正丁醇液（必要时可离心），重复操作3次，合并正丁醇液用20mL氨试液（9.4.3）洗涤，重复操作2次，弃去氨试液，以适宜方式（水浴、减压或氮吹）除去正丁醇液后，残渣用甲醇（9.1.1）溶解并转移至25mL量瓶中（液体样品则转移至10mL量瓶中），加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，备用。
11.2 标准曲线的制作
吸取人参皂苷Re标准溶液（9.3）0.0mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL于10mL具塞比色管中，置水浴中挥干溶剂，加入0.2mL香草醛溶液（9.4.1），再加入0.8mL高氯酸（9.1.6），混匀，使残渣全部溶解，置60℃水浴中加热10min，取出，冰浴冷却后，加入5.0mL冰乙酸（9.1.7），摇匀后，以相应试剂为空白，立即于560nm波长处测定吸光度。
11.3 试样溶液的测定
取11.1.2项下备用溶液1.0mL于10mL具塞比色管中，从11.2 “置水浴中挥干溶剂……”起，与标准溶液同法测定吸光度。
11.4 背景校正（如样品不存在背景干扰，无需校正）
吸取11.1.2项下备用溶液1.0mL于10mL具塞比色管中，置水浴中挥干溶剂，加入0.2mL冰乙酸（9.1.7），从11.2 “再精密加入0.8 mL高氯酸（9.1.6）……”起，与试样同法测定吸光度，做试样背景校正。
12 结果计算
试样中总皂苷含量（以人参皂苷Re计）按下式计算:
式中:
Xi—试样中总皂苷的含量（以人参皂苷Re计），单位为毫克每百克（mg/100g）或毫克每百毫升（mg/100mL）；
Ci—经试样背景校正后，由标准曲线算得被测液中人参皂苷Re质量，单位为毫克（mg） ；
V—被测样品的稀释体积，单位为毫升（mL）；
V0—用于显色的样液体积，单位为毫升（mL）；
m—试样取样量，单位为克（g）或毫升（mL）；
100—单位转换。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。
13 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 。
